1、分區(qū)設(shè)置

 

      臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。

      在理想情況下，PCR實(shí)驗(yàn)室試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備、擴(kuò)增三個(gè)區(qū)域可設(shè)置緩沖間。

·各工作區(qū)域完全相互獨(dú)立；

·各工作區(qū)域之間無(wú)條件設(shè)置緩沖間；

·按各區(qū)域要求設(shè)置實(shí)驗(yàn)室壓力；

·若各區(qū)緊密相連，需安裝物品傳遞艙；

·人流、物流單一方向流動(dòng)；

·各區(qū)儀器設(shè)備、清潔用具明確標(biāo)記，不得混用；

·各區(qū)使用不同的實(shí)驗(yàn)服，實(shí)驗(yàn)服不得帶出

·工作結(jié)束后立即清潔

2、各區(qū)功能及設(shè)置

 

2.1 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

區(qū)域功能：

      所有試劑的配制與分裝，主反應(yīng)混合液的制備，試劑原材料和配制試劑的貯存。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。

            本區(qū)對(duì)與氣流壓力的控制，沒(méi)有嚴(yán)格要求。

儀器設(shè)備：

超凈工作臺(tái)                                  高速離心機(jī)                                電子天平 

2～8℃和-20℃以下冰箱               混勻器                                      微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）

可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）       專用工作服和工作鞋                   專用辦公用品

消耗品（一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭）

2.2 標(biāo)本制備區(qū)

區(qū)域功能：

      臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。 臨床樣本應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料：必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

      本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。

儀器設(shè)備：

2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱        高速離心機(jī)                         混勻器

水浴箱或加熱模塊                            微量加樣器                         可移動(dòng)紫外燈

生物安全柜                                      專用工作服和工作鞋            專用辦公用品

超聲波水浴儀                                   消耗品（一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭）

2.3 擴(kuò)增區(qū)

區(qū)域功能：

      該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

      本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

儀器設(shè)備：

熒光定量PCR儀                           PCR擴(kuò)增儀                          超凈工作臺(tái)（生物安全柜）

低溫、冷藏冰箱                           微量加樣器                         可移動(dòng)紫外燈

專用工作服和工作鞋                    專用辦公用品                       消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭

2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

區(qū)域功能：

      該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。

      本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

儀器設(shè)備：

      視檢驗(yàn)方法不同而定。基本儀器設(shè)備如下：

微量加樣器                                  微波爐                                 電泳儀

凝膠成像系統(tǒng)                               可移動(dòng)紫外燈                      專用工作服和工作鞋

專用辦公用品                               消耗品（一次性手套、加樣器吸頭）

3、工作人員操作要求

 

實(shí)驗(yàn)操作中                                                                                  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后

一次性手套和帽子                                                                        立即進(jìn)行清潔

正確使用加樣器，避免產(chǎn)生氣溶膠污染                                          實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、超凈臺(tái)10%次氯酸鈉溶液擦拭

實(shí)驗(yàn)材料散落或PCR產(chǎn)物外濺時(shí)，立即清潔處理并做記錄                實(shí)驗(yàn)室空間定期紫外照射

                                                                                                   實(shí)驗(yàn)室和設(shè)備的使用必須有日常記錄

4、試劑

 

等級(jí)                                   實(shí)驗(yàn)用水                                   試劑配置                                      質(zhì)量控制

不含DNA和DNase             一級(jí)水                                    大體積配置，小體積分裝。             關(guān)鍵試劑質(zhì)量檢測(cè)

的分析純和生化試劑                                                          標(biāo)注名稱、濃度、配置者、

                                                                                         保存條件、失效時(shí)間

5、防止污染

 

      PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

      嚴(yán)格分區(qū)：工作服；實(shí)驗(yàn)用具；實(shí)驗(yàn)記錄本

      樣品管理：包裝完好；明確標(biāo)識(shí)；避免交叉污染

      擴(kuò)增產(chǎn)物：PCR反應(yīng)液加UDG酶；dUTP代替dTTP

      RNase：玻璃器皿和溶液經(jīng)DEPC處理；實(shí)驗(yàn)起始階段使用RNase抑制劑；實(shí)驗(yàn)操作在冰浴中進(jìn)行。

      污染后處理：環(huán)境污染源檢測(cè)；材料散落、產(chǎn)物外濺立即清潔并記錄

6、安全防護(hù)

 

      放射線：依據(jù)GB11930-2010操作非密封源的輻射防護(hù)

      紫外線：防護(hù)目鏡和面罩

      溴化乙錠：一次性腈類手套、固定區(qū)域與容器

      細(xì)菌培養(yǎng)物：培養(yǎng)物及其平皿121℃、30min消毒后丟棄

7、廢棄物處理

 

      吸頭：使用過(guò)必須放入專門的消毒容器（含10%的次氯酸鈉溶液）內(nèi)浸泡不少于24h；污染PCR產(chǎn)物必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒

      廢液：含有PCR產(chǎn)物的任何廢液必須收集至1 mol/L HCl中，浸泡時(shí)間不少于6h,并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)當(dāng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉

      含EB：含有EB或經(jīng)過(guò)EB浸泡的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液凈化處理

      陽(yáng)性樣品：GB/T 19495.1-2004

      陽(yáng)性質(zhì)粒：1mol/LHCl浸泡不少于6h